產品優(yōu)勢：
該款培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和添加劑兩部分?；A培養(yǎng)基中含有多種氨基酸、微量元素等，已添加Hepes和L-谷氨酰胺。添加劑中含有多種細胞因子和重組人白蛋白等成分?？捎行У木S持體外培養(yǎng)的間充質干細胞的干性及功能性，為基礎及臨床研究提供了安全性和有效性的保障。
應用舉例
采用酶消化法從健康臍帶組織華通氏膠中分離MSC，全程采用本培養(yǎng)基及附帶的添加劑培養(yǎng)，無血清或其他成分添加。記錄細胞形態(tài)變化（圖1-4）并檢測表面標志（圖5）。
圖1 消化法原代培養(yǎng)的人臍帶組織MSC(Day3)(Bar:100 μm)
原代細胞培養(yǎng)3天后，PBS洗滌去除未貼壁細胞，可見大量貼壁細胞，均勻分布，形狀近似梭形。
圖2 P1代人臍帶組織MSC(Bar:100 μm)
原代細胞80%融合后胰酶消化，按1：3傳代，傳代后第三天拍照，可見細胞呈細梭形，胞體折光性好，分裂相多，背景干凈。
圖3 P5代人臍帶組織MSC(Bar:100 μm)
細胞傳至第5代，細胞形態(tài)仍為長梭形，未發(fā)生肥大、顆?；痊F(xiàn)象，細胞增殖活躍，仍處于良好生長狀態(tài)。
圖4 P9代人臍帶組織MSC(Bar:100 μm)
傳代至第9代時，細胞仍保持較好的增殖狀態(tài)。細胞凸起略變長，但仍保持梭形，沒有出現(xiàn)肥大、顆粒化現(xiàn)象。
CONTROL
CD31-FITC-CD44-PE
CD45-FITC/CD73-PE
CD29-PE
圖5 P5代人臍帶組織MSC表型流式分析。流式結果顯示，P5代細胞99%以上具有MSC典型表面標志特征（CD45-,CD31-,CD73+,CD44+）
產品概述
本產品適用于人間充質干細胞體外培養(yǎng)，尤其適用于臍帶、胎盤和脂肪組織來源提取的間充質干細胞的培養(yǎng)，包括基礎培養(yǎng)基和添加劑兩部分?；A培養(yǎng)基中含有多種氨基酸、微量元素等，已添加Hepes和L-谷氨酰胺。添加劑中含有多種細胞因子和重組人白蛋白等成分。為保障活性，建議添加劑部分一次解凍后分裝再凍存，不宜反復凍融。
技術指標
（一）基礎培養(yǎng)基
1．物理性狀：紅色，澄清透明。pH 7.1-7.4
2．細菌培養(yǎng)：陰性
3．真菌培養(yǎng)：陰性
4．熱 源：≤0.25 U/ml
5．細胞生長：良好
（二）添加劑
1．物理性狀：黃色透明。pH 6.0-7.0
2．熱 源：≤0. 25 U/ml
3．細胞生長：良好
微生物檢測項目：
檢測項目名稱 | 檢測方法 | 檢測結果 | 單位 | 參考值 |
EB病毒 | 核酸擴增熒光定量 | ＜5.00E+02 | copies/mL | ＜5.00E+02 |
巨細胞病毒 | 核酸擴增熒光定量 | ＜5.00E+02 | copies/mL | ＜5.00E+02 |
乙型肝炎病毒 | 核酸擴增熒光定量 | ＜1.00E+02 | IU/mL | ＜1.00E+02 |
丙型肝炎病毒 | 核酸擴增熒光定量 | ＜5.00E+01 | IU/mL | ＜5.00E+01 |
解脲支原體 | 核酸擴增熒光定量 | 陰性 |
| 陰性 |
單純皰疹病毒II型 | 核酸擴增熒光定量 | 陰性 |
| 陰性 |
沙眼衣原體 | 核酸擴增熒光定量 | 陰性 |
| 陰性 |
解脲支原體 | 培養(yǎng) | 陰性 |
| 陰性 |
肺炎支原體 | 培養(yǎng) | 陰性 |
| 陰性 |
細菌 | 培養(yǎng) | 陰性 |
| 陰性 |
真菌 | 培養(yǎng) | 陰性 |
| 陰性 |
艾滋病抗體/P24抗原 | ELISA | 陰性 |
| 陰性 |
梅毒特異性抗體 | ELISA | 陰性 |
| 陰性 |
肺炎支原體抗體 | ELISA | 陰性 |
| 陰性 |
產品規(guī)格
產品貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 儲存條件 | 運輸條件 |
1001A | 人MSC培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基 | 500 ml | 4 °C | 冰袋 |
1001B | 人MSC添加劑 | 25 ml | -20 °C | 干冰 |
操作方法
一、完全培養(yǎng)基的配制
將添加劑（25 ml）室溫或2-8 °C過夜融化，加入500 ml基礎培養(yǎng)基中，即為完全培養(yǎng)基。為維持添加劑中細胞生長因子的活性，請將配制的完全培養(yǎng)基置于4 °C避光保存，儲存時間不宜長于4周，2周內用完最佳。
二、人骨髓間充質干細胞培養(yǎng)
1、 將骨髓樣品制備成單細胞懸液，推薦使用密度梯度離心法獲得單個核細胞進行以下實驗。
★ 注意：人骨髓單個核細胞的分離，可采用Ficoll-Hypaque（比重1.077 g/ml），或Percoll（比重1.073 g/ml）。后者毒性小，且分離細胞純度較好。
2、 PBS或基礎培養(yǎng)基清洗細胞兩次。
★ 注意：兩次離心速度不同。第一次收集的細胞懸液中含有Ficoll-Hypaque或Percoll，應加足量PBS稀釋，離心速度高。第二次離心時，可用常規(guī)速度沉降細胞。
3、 棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞。
4、 細胞計數(shù)，調整細胞濃度為5-7.5×106 /ml。
5、 根據(jù)擬采用培養(yǎng)瓶或皿的底面積，計算接種細胞總量。一般而言，細胞來源不同，接種密度可適當調整， 5-10×105 /cm2適于多數(shù)情況下人骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)。如細胞來源于粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員的骨髓或經膠原酶消化的骨髓小粒，接種密度可較低；如細胞來源于化療后骨髓或老年人，細胞接種密度可達1.0×106 /cm2。
6、 將接種好的細胞于條件為溫度37 °C、CO2濃度5%、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況換液。
★ 注意：一般文獻推薦培養(yǎng)48小時后去除非貼壁細胞。然而，根據(jù)我們的專利技術，骨髓單個核細胞培養(yǎng)48小時后，將貼壁細胞與非貼壁細胞分別培養(yǎng)，兩種體系都收獲的骨髓MSC數(shù)量相近。因此，我們強烈推薦：單個核細胞接種次日觀察有無污染；如無污染現(xiàn)象，可持續(xù)培養(yǎng)5-7天，或至培養(yǎng)基變黃。之后，去除非貼壁細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，常可獲得更多的間充質干細胞。
三、人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)
1. 按照常規(guī)方法分離人臍帶Walton膠中的細胞。
★ 注意：從臍帶組織中分離細胞的方法，嚴重影響最終所得細胞純度和質量。臍帶組織中含有內皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、外膜細胞、間充質干細胞乃至單核巨噬細胞等。以上細胞均可貼壁，有些生長速度也較快，且細胞也多呈紡錘形。更有趣的是，部分細胞也表達CD29，CD44，CD73等表面標記。這些細胞不易與間充質干細胞區(qū)分。建議使用酶消化法進行臍帶間充質干細胞的分離，以保障所得細胞純度。
2. PBS清洗細胞1次。
3. 棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞。
4. 細胞計數(shù)，調整細胞濃度為5×106 /ml。
5. 根據(jù)擬采用培養(yǎng)瓶或皿的底面積，計算接種細胞總量。一般而言，一根正常的臍帶，經消化后可接種于2-4個直徑為150 mm的培養(yǎng)皿。
6. 將接種好的細胞置于5% CO2和飽和濕度的37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況換液。
★ 注意：一般文獻推薦培養(yǎng)48小時后去除非貼壁細胞。我們建議：培養(yǎng)次日觀察有無污染；如無污染現(xiàn)象，可持續(xù)培養(yǎng)5-7天，或至培養(yǎng)基顏色變黃。之后，去除非貼壁細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
四、脂肪間充質干細胞的分離
1. 人脂肪組織來自脂肪抽吸患者的廢棄脂肪組織。
2. 無菌PBS反復漂洗除菌。
3. 將脂肪組織轉移至50 ml或250 ml離心管，加入等體積的使用alpha-MEM配制的膠原酶I溶液，使其終濃度達到0.1%（重量/體積）。
4. 37 °C，搖床（120rpm）消化2小時以上。
5. 室溫靜置10 min，吸除上層油滴。
6. 離心，800 g，10 min，收集消化細胞。
7. PBS洗滌一次，500 g，10 min。MSC無血清完全培養(yǎng)基懸浮細胞。
8.計細胞數(shù)，調整細胞濃度，按照5.0×105-1.0×106 /cm2底面積接種。
9.次日觀察，如無污染，繼續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色變黃，或貼壁細胞密度達到30%以上。補充新鮮的MSC無血清完全培養(yǎng)基。
10. 細胞密度達到80%左右時，按照以下步驟傳代培養(yǎng)。
五、間充質干細胞的換液
吸去舊的間充質干細胞的完全培養(yǎng)液，加入足量新鮮的預熱至37 °C的間充質干細胞完全培養(yǎng)液。
換液時間：當間充質干細胞的完全培養(yǎng)液變酸（培養(yǎng)液的顏色變黃），而且此時細胞尚未達到80%融合，則應該予以換液。一般來說，間質干細胞的換液間隔為3-4天。
六、間充質干細胞的傳代
間充質干細胞生長至80％融合時，就應該按照下面步驟進行傳代。
★注意：為維持間充質干細胞的多向分化能力和增殖能力，強烈建議細胞達80%時即進行傳代培養(yǎng)。如細胞密度過大，細胞會出現(xiàn)自發(fā)分化現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞大小不一，I型膠原等胞外基質分泌量明顯增加，導致使用胰蛋白酶消化時，細胞成片脫落，最終收獲的細胞數(shù)反而下降。因此，不可讓間充質干細胞完全融合或過度融合，這將嚴重影響細胞傳代后的生長狀態(tài)。
1. 吸去培養(yǎng)液。
2. 用1×PBS洗滌細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)液。
★注意：使用無血清體系培養(yǎng)的間充質干細胞，其貼壁能力遠不及血清培養(yǎng)細胞。因此，如用培養(yǎng)皿培養(yǎng)，建議沿培養(yǎng)皿的側壁緩緩加入PBS；如用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，建議沿培養(yǎng)瓶的上壁加入PBS，以免細胞脫落，影響收獲細胞數(shù)。
3. 加入PBS，之后加入0.25％ Trypsin-0.02% EDTA，PBS與胰蛋白酶體積比為4:1，兩者總量以覆蓋培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表面為宜。輕輕旋轉，置37 °C培養(yǎng)箱中消化3－5分鐘。用手輕拍培養(yǎng)器皿的側壁，顯微鏡下可見絕大部分細胞變圓，極少量細胞貼壁仍呈紡錘形，極少量細胞已經懸浮即可終止消化。依據(jù)不同批次胰蛋白酶活性不同，消化的時間以顯微鏡下觀察細胞變圓為準，但是，推薦消化時間不低于3分鐘。
★注意：對于人間充質干細胞，尤其是利用該體系培養(yǎng)的細胞而言，其消化脫壁的時間應該較短，難以消化脫壁的細胞多數(shù)可能不是間充質干細胞，而是其他的雜細胞。在原代培養(yǎng)第一次傳代時，尤其注意消化時間；如將所有細胞收獲，其中必然含有單核巨噬細胞等雜細胞。
4. 立即加入等體積的間充質干細胞完全培養(yǎng)液，用吸管吸取液體，反復吹打培養(yǎng)器皿底壁，使細胞徹底脫離瓶/皿底壁。
★注意：吹打時動作不宜太猛，不要產生氣泡。對于一個細胞而言，氣泡的張力很大，氣泡的破裂足以殺死周圍的細胞，使細胞內基因組DNA釋放，細胞呈粘稠的團狀物，嚴重影響了收獲數(shù)量和質量。
5. 離心（250 g，5 min），吸去上清液。
6. 用2－3 ml間充質干細胞的完全培養(yǎng)液重懸細胞。
7. 按照6000個細胞/cm2的密度來接種細胞。
★注意：一般而言，早期代次（1-3代）MSC按照1:3-5傳代，5代以后的細胞以1:2傳代較好。
8. 加足夠的間充質干細胞的完全培養(yǎng)液，在37 °C，5％CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
七、 間充質干細胞凍存
1. 細胞消化和計數(shù)，用胰酶對待凍存的細胞進行消化，并對細胞進行計數(shù)。
2. 500 g，離心5-8 min，去掉上清。
3. 根據(jù)細胞計數(shù)的情況，加入適量的凍存液，使細胞密度在1×106/ml左右（或根據(jù)自己希望達到的細胞密度）。
4. 輕輕地重懸細胞（務必重懸均勻），將重懸的細胞按等份加入到滅菌的凍存管（需提前做好標記或者貼上標簽）中，旋緊凍存管蓋。
5. 將凍存管放入程序降溫凍存盒中，然后將凍存盒直接放入-80 °C。
6. 第二天將細胞從-80 °C轉移到液氮中。
八、間充質干細胞復蘇
1.配制人間充質干細胞無血清完全培養(yǎng)基，放入37 °C水浴中預熱，離心管中加入預熱的適量培養(yǎng)基；
2.從液氮中取出間充質干細胞迅速放入37 °C水浴快速解凍；
3.將復蘇細胞滴加入預熱的完全培養(yǎng)基中，500 g離心5-8 min；
4.棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于37 °C，5% CO2、飽和濕度的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
