產(chǎn)品概述
本產(chǎn)品是一種化學(xué)成分明確、無(wú)人和動(dòng)物血清、無(wú)任何動(dòng)物成分的培養(yǎng)基，適用于人外周血、臍帶血、骨髓等來(lái)源NK細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增。產(chǎn)品中所有蛋白質(zhì)成分均為重組技術(shù)獲得，包括重組人白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種成分。產(chǎn)品不含任何抗生素。
激活劑，為特異性活化NK細(xì)胞而設(shè)計(jì)。含有特殊的活性物質(zhì)，鱟試劑法測(cè)定熱源兩者均為陽(yáng)性（≥0.5U/ml，鱟試劑法）。然而，在培養(yǎng)過(guò)程中，該成分不會(huì)存在于細(xì)胞終產(chǎn)品中，因此，細(xì)胞產(chǎn)品熱源測(cè)定應(yīng)為陰性。
使用該套裝，培養(yǎng)起始細(xì)胞可以為外周血、胎盤/臍帶血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞。一般而言，使用該套裝培養(yǎng)14天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增100倍以上，CD56+細(xì)胞比例超過(guò)80%，最高可達(dá)到97%。
激活劑4°C儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。人NK細(xì)胞優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基4°C儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。重組人IL-15應(yīng)于 4°C保存，有效期為24個(gè)月。
所有成分均應(yīng)避光保存，不宜劇烈震蕩，以免大分子物質(zhì)因變性而失活。
技術(shù)指標(biāo)
（一） NK優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基
1. 淺紅色，透明，pH7.1-7.4
2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）
3. 真菌培養(yǎng)（陰性）
4. 熱源（鱟試劑法）≤0.25U/ml
5. NK92細(xì)胞生長(zhǎng)：良好
（二） 激活劑
1. 淺白色，半透明
2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）
3. 真菌培養(yǎng)（陰性）
（三）重組人IL-15
1.白色粉末
2.細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）
3.真菌培養(yǎng)（陰性）
產(chǎn)品規(guī)格
產(chǎn)品貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存條件 | 運(yùn)輸條件 |
1002A | NK激活劑 | 1ml×2 | 4°C | 冰袋 |
1008 | 重組人IL-15 | 100ug | 4°C | 冰袋 |
1002C | 人NK優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基 | 1000ml×2 | 4°C | 冰袋 |
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產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：
該款培養(yǎng)基是一種化學(xué)成分明確、無(wú)人和動(dòng)物血清的培養(yǎng)基，屬于animal component free級(jí)別。使用該培養(yǎng)基無(wú)需任何腫瘤細(xì)胞系作為滋養(yǎng)層，即可滿足臍帶血、外周血、骨髓來(lái)源NK細(xì)胞的擴(kuò)增，培養(yǎng)2周NK細(xì)胞擴(kuò)增1000倍以上，從而為NK細(xì)胞免疫治療臨床應(yīng)用提供了安全性和有效性保障。
應(yīng)用舉例
外周血來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞
圖1 培養(yǎng)中的NK細(xì)胞之培養(yǎng)48小時(shí)細(xì)胞狀態(tài)(標(biāo)示：Bar:100 μm)
將外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照說(shuō)明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)48小時(shí)，可見(jiàn)多個(gè)由十?dāng)?shù)個(gè)細(xì)胞組成的簇（cluster），尤其是在培養(yǎng)瓶邊緣處多見(jiàn)。
依據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，在培養(yǎng)早期，這種貼壁的簇主要由NK細(xì)胞組成。如果在培養(yǎng)早期出現(xiàn)較多懸浮的簇或集落（colony），提示T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增顯著，可能影響最終收獲時(shí)NK細(xì)胞的比例。
圖2 培養(yǎng)中的NK細(xì)胞之培養(yǎng)7天細(xì)胞狀態(tài)(Bar:100μm)。
將外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照說(shuō)明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)一周時(shí)，貼壁的簇或集落逐漸脫壁，懸浮于培養(yǎng)液中。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，如果10×10視野中，較大集落超過(guò)3個(gè)，或培養(yǎng)基變黃，提示應(yīng)該補(bǔ)液。
圖3 NK細(xì)胞之培養(yǎng)7天流式檢測(cè)結(jié)果
收獲人外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照試劑盒提供的方法培養(yǎng)一周后，收集細(xì)胞進(jìn)行抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE標(biāo)記，F(xiàn)ACSCalibur收集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowjo軟件分析?？梢?jiàn)主要為三群細(xì)胞，分別是NK細(xì)胞(CD3-/CD56+)、T淋巴細(xì)胞(CD3+/CD56-)和多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK，CD3+/CD56+)。
將外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照說(shuō)明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)7天時(shí)，多數(shù)情況下，NK細(xì)胞(CD3-/CD56+)比例在30-70%之間。但是，在某些情況下(如腫瘤病人外周血NK培養(yǎng))，培養(yǎng)一周時(shí)以CD3+/CD56+細(xì)胞為主，比例可在40%左右。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CD3和CD56雙陽(yáng)性比例下降，CD3-/CD56+細(xì)胞比例逐漸上升。
圖4 NK細(xì)胞之培養(yǎng)14天流式檢測(cè)結(jié)果
將外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照說(shuō)明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)14天時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析?？梢?jiàn)細(xì)胞群體中以NK細(xì)胞(CD3-/CD56+)為主。
在多數(shù)情況下，NK細(xì)胞(CD3-/CD56+)比例在80%以上，最高可達(dá)97%。然而，少數(shù)情況下(如腫瘤病人外周血NK細(xì)胞培養(yǎng))，CD56陽(yáng)性細(xì)胞比例雖可達(dá)到80%以上，但多數(shù)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56(如下圖所示)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因未明，也值得進(jìn)一步探討。
圖5 外周血培養(yǎng)2周時(shí)流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果
抽取某一肝癌患者(男，61歲)外周血，進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞分離，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行培養(yǎng)2周，F(xiàn)CM分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞群體中以多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK，CD3+/CD56+)為主。
產(chǎn)品概述
本產(chǎn)品是一種化學(xué)成分明確、無(wú)人和動(dòng)物血清、無(wú)任何動(dòng)物成分的培養(yǎng)基，適用于人外周血、臍帶血、骨髓等來(lái)源NK細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增。產(chǎn)品中所有蛋白質(zhì)成分均為重組技術(shù)獲得，包括重組人白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種成分。產(chǎn)品不含任何抗生素。
激活劑是為特異性活化NK細(xì)胞而設(shè)計(jì)。激活劑中含有特殊的活性物質(zhì)，鱟試劑法測(cè)定熱源兩者均為陽(yáng)性（≥0.5U/ml，鱟試劑法）。然而，在培養(yǎng)過(guò)程中，該成分不會(huì)存在于細(xì)胞終產(chǎn)品中，因此，細(xì)胞產(chǎn)品熱源測(cè)定應(yīng)為陰性。
使用該套裝，培養(yǎng)起始細(xì)胞可以為外周血、胎盤/臍帶血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞。一般而言，使用該套裝培養(yǎng)14天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增100倍以上，CD56+細(xì)胞比例超過(guò)80%，最高可達(dá)到97%。
激活劑4°C儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。NK細(xì)胞篩選擴(kuò)增培養(yǎng)基均4°C儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。
所有成分均應(yīng)避光保存，不宜劇烈震蕩，以免大分子物質(zhì)因變性而失活。
技術(shù)指標(biāo)
（一） 激活劑
1. 淺白色，半透明
2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）
3. 真菌培養(yǎng)（陰性）
（二） NK優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基
1. 淺紅色，透明，pH7.1-7.4
2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）
3. 真菌培養(yǎng)（陰性）
4. 熱源（鱟試劑法）≤0.25U/ml
5. NK92細(xì)胞生長(zhǎng)：良好
產(chǎn)品規(guī)格
產(chǎn)品貨號(hào) | 描述 | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存條件 | 運(yùn)輸條件 |
1002A | 激活劑 | 1ml×2 | 4°C | 冰袋 |
1008 | IL-15 | 100ug | 4°C | 冰袋 |
1002C | NK優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增液 | 1000ml×2 | 4°C | 冰袋 |
操作方法
本操作方法以采集30-50 ml外周血為例，介紹NK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)的具體方法。請(qǐng)仔細(xì)閱讀操作手冊(cè)，尤其注意每個(gè)提醒事項(xiàng)。
1. 培養(yǎng)瓶鋪板
（1） 建議使用適于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶，如由Corning公司生產(chǎn)、底面積為75cm2或175cm2的培養(yǎng)瓶。
（2） 將激活劑（1 ml）置于37°C復(fù)溫10 min，輕輕混勻。
（3） 培養(yǎng)瓶（175 cm2,Corning）加入激活劑2.0 ml，生理鹽水8ml，混勻?；蛘?，按照下表提供的參數(shù)，使用其它培養(yǎng)瓶鋪板。應(yīng)提前至少24h鋪板，也可將鋪好的培養(yǎng)瓶置于4°C，可儲(chǔ)存2周。
（4） 可參考以下表格，包被其它型號(hào)的培養(yǎng)瓶。
培養(yǎng)瓶（底面積） | 25 cm2 | 75 cm2 | 175 cm2 | 225 cm2 |
激活劑體積 | 1000 ul | 2000 ul | 3.0ml | 4.0 ml |
生理鹽水 | 5 ml | 10 ml | 20 ml | 30 ml |
2. 單個(gè)核細(xì)胞分離、血漿采集及處理
1) 開(kāi)啟水浴箱，調(diào)整溫度至56 °C，以備滅活補(bǔ)體用。
2) 常規(guī)無(wú)菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。
3) 分離單個(gè)核細(xì)胞前，將已經(jīng)預(yù)鋪板的培養(yǎng)瓶放置37°C。
4) 常規(guī)Ficoll-Hypaque密度梯度離心。建議關(guān)閉離心機(jī)剎車（brake off）。
5) 吸取上層稀釋的血漿，56 °C，30 min滅活補(bǔ)體，之后立即置于-20°C靜置2 min，離心（3000 g,15-30 min）以去除血小板。
6) 收取單個(gè)核細(xì)胞層，生理鹽水充分混勻。離心洗滌。
7) 生理鹽水懸浮細(xì)胞沉淀，再次離心洗滌。
8) 使用NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。計(jì)細(xì)胞數(shù)。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)
1) 取出已經(jīng)預(yù)鋪板且置于37°C孵育的培養(yǎng)瓶，吸凈稀釋的激活劑。沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入少量生理鹽水，輕輕洗滌瓶底。吸除。
2) 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞終濃度調(diào)整為3×106/ml。單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入IL-2，IL-15和自體血漿，自體血漿終濃度為10%，IL-2和IL-15終濃度分別為1000U/ml及50ng/ml。
細(xì)胞濃度以及接種培養(yǎng)瓶的表面積，是決定最終培養(yǎng)NK細(xì)胞比例的兩個(gè)關(guān)鍵因素。我們推薦細(xì)胞密度在3×106/ml左右，同時(shí)，根據(jù)接種細(xì)胞體積選擇適宜底面積的培養(yǎng)瓶。下表可作為參考。
培養(yǎng)瓶（底面積） | 25 cm2 | 75 cm2 | 175 cm2 | 225 cm2 |
細(xì)胞懸液總體積 | 2.5-5 ml | 7.5-10 ml | 15-20 ml | 25-30 ml |
細(xì)胞總數(shù) | 0.75-1.5×107 | 2-3×107 | 4.5-6×107 | 7.5-9×107 |
3) 將細(xì)胞懸液加入已經(jīng)預(yù)鋪板的培養(yǎng)瓶中，37°C，5% CO2和100%濕度下培養(yǎng)。次日，觀察是否有污染現(xiàn)象；如無(wú)，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)。
4) 96小時(shí)后補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基含IL-2（2000 U/ml）、IL-15（100 ng/ml）和自體血漿2.5-5%。一般情況下，補(bǔ)充液體量為原體積的一倍。
5) 繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液變黃后，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基含血漿5%，IL-2（1000 U/ml）和IL-15（50 ng/ml）。補(bǔ)液量一般為補(bǔ)液前原體積的1倍。細(xì)胞應(yīng)在預(yù)鋪板的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至少一周。
6) 當(dāng)原瓶培養(yǎng)基變黃、總體積接近或達(dá)到培養(yǎng)瓶最大體積時(shí)，添加等量含血漿5%，IL-2（1000 U/ml）和IL-15（50 ng/ml）的培養(yǎng)基，并分瓶培養(yǎng)。
NK細(xì)胞集落常貼壁，可以通過(guò)以下方法使貼壁集落懸?。海?）輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，使貼壁的集落懸?。唬?）或通過(guò)吸管吹打，使貼壁的集落懸??；（3）如仍有較多集落貼壁，則將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶后，加入需要補(bǔ)充的冷新鮮培養(yǎng)基，置于超凈臺(tái)中5min，之后輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，則大部分集落可脫落，與其它細(xì)胞混合后培養(yǎng)。
7) 按照50-100 ml/瓶（225 cm2），將細(xì)胞擴(kuò)增轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶，原瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)?；蛘撸瑢⑺屑?xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)培養(yǎng)袋培養(yǎng)。
8) 每天觀察培養(yǎng)基顏色、細(xì)胞集落大小及細(xì)胞密度，及時(shí)補(bǔ)充含血漿、IL-2和IL-15的新鮮培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基總量為原來(lái)體積（等量補(bǔ)液）。每次補(bǔ)液前，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，使貼壁的集落懸浮。一般而言，每天或每2天需要補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。
9) 培養(yǎng)12-15天，細(xì)胞數(shù)達(dá)到目的用量后，可進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，之后收獲細(xì)胞。
4. 細(xì)胞收獲
1) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至500 ml離心管，計(jì)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活力。
2) 離心收獲細(xì)胞，速度為500 g，時(shí)間為15 min。
3) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至250 ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌，500 g，15 min。
4) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50 ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌，500 g，10 min。
5) 用含1%注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞。
6) 使用孔徑為70 μm的細(xì)胞篩（cell strainer）過(guò)濾細(xì)胞。
7) 留小樣備質(zhì)檢。
8）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至輸液袋中。靜置于室溫。
5. 注意事項(xiàng)
（1）預(yù)鋪板時(shí)間要長(zhǎng)，至少過(guò)夜，或鋪板后密閉培養(yǎng)瓶瓶口，4 °C最長(zhǎng)可儲(chǔ)存2周。
（2）初始接種體積不易過(guò)大，最大量為30 ml/225 cm2培養(yǎng)瓶，20 ml/175 cm2培養(yǎng)瓶，10 ml/75 cm2培養(yǎng)瓶，5 ml/25 cm2培養(yǎng)瓶。將單個(gè)核細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)超過(guò)1周，常可達(dá)到較好的效果。
（3）自體血漿制備過(guò)程中去除血小板要徹底，過(guò)多的血小板會(huì)影響NK細(xì)胞活化。自體血漿不夠或不適宜培養(yǎng)時(shí)，可用人AB混合血漿。將多份（建議5份以上）人AB血漿凍融后混合，離心（3000g，至少15 min）去除血小板，并添加注射用肝素鈉10 U/ml，以防形成凝膠。
