產(chǎn)品概述

      本產(chǎn)品是一種化學(xué)成分明確、無(wú)人和動(dòng)物血清、無(wú)任何動(dòng)物成分的培養(yǎng)基，適用于人外周血、臍帶血、骨髓等來(lái)源CIK細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增。產(chǎn)品中所有蛋白質(zhì)成分均為重組技術(shù)獲得，包括重組人白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種成分。產(chǎn)品不含任何抗生素。

      激活劑，為特異性活化CIK細(xì)胞而設(shè)計(jì)。激活劑中含有特殊的活性物質(zhì)，鱟試劑法測(cè)定熱源兩者均為陽(yáng)性（≥0.5U/ml）。然而，在培養(yǎng)過(guò)程中，該成分不會(huì)存在于細(xì)胞終產(chǎn)品中，因此，細(xì)胞產(chǎn)品熱源測(cè)定應(yīng)為陰性。   

      使用該套裝，培養(yǎng)起始細(xì)胞可以為外周血、胎盤(pán)/臍帶血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞。一般而言，使用該套裝培養(yǎng)14天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增100倍以上，CD3⁺/CD56⁺細(xì)胞比例超過(guò)30%，CD56⁺細(xì)胞可達(dá)到50%以上。

      激活劑4°C儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。CIK細(xì)胞優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基均4°C儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。重組人IL-15應(yīng)于 4°C儲(chǔ)存，保質(zhì)期24個(gè)月。

      所有成分均應(yīng)避光保存，不宜劇烈震蕩，以免大分子物質(zhì)因變性而失活。

技術(shù)指標(biāo)

     （一） CIK優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基

      1. 淺紅色，透明，pH7.1-7.4

      2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）

      3. 真菌培養(yǎng)（陰性）

      4. 熱源（鱟試劑法）≤0.25U/ml

      5. NK92細(xì)胞生長(zhǎng)：良好
   （二） 激活劑

      1. 淺白色，半透明

      2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）

      3. 真菌培養(yǎng)（陰性）
   （三）重組人IL-15
       1.白色粉末
       2.細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）
       3.真菌培養(yǎng)（陰性）

產(chǎn)品規(guī)格

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產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

       該款培養(yǎng)基是一種化學(xué)成分明確、無(wú)人和動(dòng)物血清的培養(yǎng)基，屬于animal component free級(jí)別。該培養(yǎng)基適用于人臍帶血、外周血、骨髓來(lái)源CIK細(xì)胞的擴(kuò)增，細(xì)胞總數(shù)可擴(kuò)增100倍以上。一般情況下，正常人外周血培養(yǎng)CIK 2周后，CD3⁺/CD56⁺細(xì)胞比例超過(guò)30%，CD56⁺細(xì)胞達(dá)到或超過(guò)50%。

       Clin-SFM?-CIK包括三個(gè)包裝，分別是CIK激活劑（1ml）、CIK輔助激活劑（30ml，4°C儲(chǔ)存）和CIK擴(kuò)增培養(yǎng)基（1L，4°C）儲(chǔ)存。CIK激活劑和輔助激活劑包含的特殊成分，促進(jìn)CD8+細(xì)胞

應(yīng)用舉例

       采取健康人抗凝無(wú)菌血30ml，按照Clin-SFM?-CIK操作手冊(cè)收集單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)。共獲得單個(gè)核細(xì)胞5*10^7個(gè)，將細(xì)胞懸浮于15ml擴(kuò)增培養(yǎng)基中，按照操作手冊(cè)進(jìn)行培養(yǎng)。2周后收集細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)達(dá)6.7*10^9個(gè)，流式細(xì)胞學(xué)分析，CIK細(xì)胞達(dá)到30%以上，  CD56+細(xì)胞達(dá)到70%以上。如圖所示。

附圖-細(xì)胞FCM分析結(jié)果(橫坐標(biāo)：CD3-FITC；縱坐標(biāo)：CD56-PE)

產(chǎn)品概述

      本產(chǎn)品是一種化學(xué)成分明確、無(wú)人和動(dòng)物血清、無(wú)任何動(dòng)物成分的培養(yǎng)基，適用于人外周血、臍帶血、骨髓等來(lái)源CIK細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增。產(chǎn)品中所有蛋白質(zhì)成分均為重組技術(shù)獲得，包括重組人白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白等多種成分。產(chǎn)品不含任何抗生素。

      激活劑為特異性活化CIK細(xì)胞而設(shè)計(jì)。激活劑中含有特殊的活性物質(zhì)，鱟試劑法測(cè)定熱源兩者均為陽(yáng)性（≥0.5U/ml）。然而，在培養(yǎng)過(guò)程中，該成分不會(huì)存在于細(xì)胞終產(chǎn)品中，因此，細(xì)胞產(chǎn)品熱源測(cè)定應(yīng)為陰性。   

      使用該套裝，培養(yǎng)起始細(xì)胞可以為外周血、胎盤(pán)/臍帶血或骨髓單個(gè)核細(xì)胞。一般而言，使用該套裝培養(yǎng)14天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增100倍以上，CD3+/CD56+細(xì)胞比例超過(guò)30%，CD56+細(xì)胞可達(dá)到50%以上。

      激活劑4°C儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。輔助激活劑及CIK細(xì)胞篩選擴(kuò)增培養(yǎng)基均4°C儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月。

      所有成分均應(yīng)避光保存，不宜劇烈震蕩，以免大分子物質(zhì)因變性而失活。

技術(shù)指標(biāo)

     （一） 激活劑

      1. 淺白色，半透明

      2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）

      3. 真菌培養(yǎng)（陰性）

     （二） CIK優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增培養(yǎng)基

      1. 淺紅色，透明，pH7.1-7.4

      2. 細(xì)菌培養(yǎng)（陰性）

      3. 真菌培養(yǎng)（陰性）

      4. 熱源（鱟試劑法）≤0.25U/ml

      5. NK92細(xì)胞生長(zhǎng)：良好

產(chǎn)品規(guī)格

【操作方法】

       本操作方法以采集外周血30ml為例，介紹CIK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)的具體方法。請(qǐng)仔細(xì)閱讀操作手冊(cè)，尤其注意每個(gè)提醒事項(xiàng)。

1. 培養(yǎng)瓶鋪板

      （1） 可使用Corning公司生產(chǎn)、適于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶。如貨號(hào)為431082，底面積為225 cm2的培養(yǎng)瓶。

      （2） 將輔助激活劑（30 ml）和激活劑（1 ml）置于37 °C復(fù)溫10 min，輕輕混勻。按照下表提供的體積，將激活劑和輔助激活劑加入培養(yǎng)瓶中。將其置于37 °C，靜置1h后可使用。也可置于4°C，過(guò)夜即可使用，或封閉培養(yǎng)瓶，可儲(chǔ)存2周。

2. 單個(gè)核細(xì)胞分離、血漿采集及處理

       1) 開(kāi)啟水浴箱，調(diào)整溫度至56 °C，以備滅活補(bǔ)體用。

       2) 常規(guī)無(wú)菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。

       3) 分離單個(gè)核細(xì)胞前，將已經(jīng)預(yù)鋪板的培養(yǎng)瓶放置37 °C。

       4) 常規(guī)密度梯度離心法，離心（800 g，25-30 min），收集單個(gè)核細(xì)胞。建議離心機(jī)處于brake-off狀態(tài)。

       5) 吸取上層血漿，56 °C，30 min滅活補(bǔ)體，之后立即置于-20 °C靜置2 min，離心（3000 g，至少15-30 min）以去除血小板。

       6) 收取單個(gè)核細(xì)胞層，生理鹽水充分混勻。離心洗滌（500 g，15 min）。

注意：吸取單個(gè)核細(xì)胞層時(shí)，吸取過(guò)多的上層血漿部分，會(huì)導(dǎo)致血小板混雜于單個(gè)核細(xì)胞群中；吸取過(guò)多的Ficoll-Hypaque，會(huì)導(dǎo)致粒細(xì)胞混雜于單個(gè)核細(xì)胞中；在洗滌用的生理鹽水中，如加入0.38%枸櫞酸鈉，可減輕血小板的混雜現(xiàn)象。

       7) 生理鹽水懸浮細(xì)胞沉淀，再次離心洗滌（500 g，8-10 min）。

       8) 使用CIK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。

       取10 ul細(xì)胞懸液，加入白細(xì)胞稀釋液（或3%冰醋酸）90 ul，混勻后計(jì)細(xì)胞數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×10⁶/ml。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)

       1) 取出已經(jīng)預(yù)鋪板且置于37 °C孵育的培養(yǎng)瓶，吸凈稀釋的激活劑。沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入少量生理鹽水，輕輕混勻后吸除。

       2) 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞終濃度調(diào)整為3×10⁶/ml。單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入IFN-gamma（2000U/ml），自體血漿濃度為2.5-5%。
       注：如使用凍存復(fù)蘇的單個(gè)核細(xì)胞，建議細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml。同樣的，如使用臍血單個(gè)核細(xì)胞作為培養(yǎng)起始細(xì)胞，建議細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml.

細(xì)胞濃度以及接種培養(yǎng)瓶的表面積，是決定最終培養(yǎng)CIK細(xì)胞比例的兩個(gè)關(guān)鍵因素。我們推薦細(xì)胞密度在3×10⁶/ml左右。同時(shí)，根據(jù)接種細(xì)胞體積選擇適宜底面積的培養(yǎng)瓶。下表可作為參考。

      3) 將細(xì)胞懸液加入已經(jīng)預(yù)鋪板的培養(yǎng)瓶中，置于37 °C、5%CO₂、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

      4) 培養(yǎng)24小時(shí)后，加入重組人IL-2（1000 U/ml）和CIK輔助激活劑（1 μg/ml）。CIK輔助激活劑可以用抗人CD3單克隆抗體替代，使用濃度為（1 μg/ml）。

      5) 繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液變黃后補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基含血漿（2.5-5%）和重組人IL-15（50ng/ml)。補(bǔ)液量一般為補(bǔ)液前原體積的1倍。也可根據(jù)細(xì)胞懸液和細(xì)胞濃度，補(bǔ)充原體積的0.5倍。一般而言，細(xì)胞應(yīng)在預(yù)鋪板的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至少一周。Corning生產(chǎn)的225 cm²培養(yǎng)瓶，最大體積可達(dá)400 ml。

      6) 當(dāng)原瓶培養(yǎng)基變黃、總體積接近或達(dá)到培養(yǎng)瓶最大體積時(shí)，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，并分瓶培養(yǎng)。分瓶時(shí)，一定將貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶。可以將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移后，再舊培養(yǎng)瓶中加入冷的生理鹽水，靜置于室溫5分鐘。之后，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，吹打后轉(zhuǎn)移至離心管收集細(xì)胞，平均分配于新的培養(yǎng)瓶中.

      7) 補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，含2.5-5%血漿和IL-15。

      8) 每天觀察細(xì)胞集落大小及細(xì)胞密度，及時(shí)補(bǔ)充含血漿和IL-15的新鮮培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基總量與原來(lái)體積相同（等量補(bǔ)液）或?yàn)樵w積的0.5倍。每次補(bǔ)液前，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，使貼壁的集落懸浮。

      9) 主要根據(jù)培養(yǎng)基顏色，每天或每隔1-2天補(bǔ)充新鮮的含血漿及細(xì)胞因子的CIK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。必要時(shí)再次轉(zhuǎn)用新的培養(yǎng)瓶擴(kuò)增。培養(yǎng)12-15天，細(xì)胞數(shù)達(dá)到目的用量后，可進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，檢測(cè)合格后收獲細(xì)胞。
      注：細(xì)胞培養(yǎng)9-10天后，為了提高擴(kuò)增效率，可在使用IL-15的基礎(chǔ)上，添加IL-2（濃度為500IU/ml).

4. 細(xì)胞收獲

      1) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至500 ml離心管，計(jì)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活力。

      2) 離心收獲細(xì)胞，500 g，15 min。

      3) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至250 ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌，500 g，15 min。

      4) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50 ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌，500 g，10 min。

      5) 用含1%注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞。

      6) 使用孔徑為70 μm的細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞。

      7) 留小樣備質(zhì)檢。

      8) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至輸液袋中。靜置于室溫。

 5. 注意事項(xiàng)

      （1）CIK細(xì)胞來(lái)源于CD8陽(yáng)性的細(xì)胞，在激活劑及IFN-gamma作用下，單核細(xì)胞分泌IL-12以促進(jìn)CD8陽(yáng)性細(xì)胞分化為CD3⁺/CD56⁺的細(xì)胞（CIK）。因此，在加入抗體和細(xì)胞因子之前，IFN-gamma作用時(shí)間不應(yīng)低于24小時(shí)。
      （2）細(xì)胞應(yīng)盡可能在原培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，或盡可能延長(zhǎng)在原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)時(shí)間。這是決定CIK細(xì)胞培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素。因此，將單個(gè)核細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)超過(guò)1周，?？蛇_(dá)到較好的效果?？梢?jiàn)，補(bǔ)液時(shí)機(jī)要把握，液體變黃才補(bǔ)液。補(bǔ)液量要明確，原體積的一倍最適宜。

      （3）自體血漿制備過(guò)程中去除血小板要徹底，過(guò)多的血小板會(huì)影響CIK細(xì)胞分化。自體血漿不夠或不適宜培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)加用人AB混合血漿，凍融后離心（3000 g，15 min）去除血小板，并添加注射用肝素鈉10 U/ml，以防形成凝膠。

質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告書(shū)

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