產(chǎn)品概述

       本產(chǎn)品是一種化學成分明確、無人和動物血清、無任何動物成分的培養(yǎng)基，適用于人外周血、臍帶血、骨髓等來源NK細胞的培養(yǎng)擴增。產(chǎn)品中所有蛋白質成分均為重組技術獲得，包括重組人白蛋白、重組人轉鐵蛋白等多種成分。產(chǎn)品不含任何抗生素。

       激活劑，為特異性活化NK細胞而設計。含有特殊的活性物質，鱟試劑法測定熱源兩者均為陽性（≥0.5U/ml，鱟試劑法）。然而，在培養(yǎng)過程中，該成分不會存在于細胞終產(chǎn)品中，因此，細胞產(chǎn)品熱源測定應為陰性。   

       使用該套裝，培養(yǎng)起始細胞可以為外周血、胎盤/臍帶血或骨髓單個核細胞。一般而言，使用該套裝培養(yǎng)14天，細胞總數(shù)擴增100倍以上，CD56+細胞比例超過80%，最高可達到97%。

       激活劑4°C儲存，有效期6個月。人NK細胞優(yōu)勢擴增培養(yǎng)基4°C儲存，有效期12個月。重組人IL-15應于 4°C保存，有效期為24個月。

       所有成分均應避光保存，不宜劇烈震蕩，以免大分子物質因變性而失活。

技術指標

      （一） NK優(yōu)勢擴增培養(yǎng)基

       1. 淺紅色，透明，pH7.1-7.4

       2. 細菌培養(yǎng)（陰性）

       3. 真菌培養(yǎng)（陰性）

       4. 熱源（鱟試劑法）≤0.25U/ml

       5. NK92細胞生長：良好
       （二） 激活劑

       1. 淺白色，半透明

       2. 細菌培養(yǎng)（陰性）

       3. 真菌培養(yǎng)（陰性）
      （三）重組人IL-15
       1.白色粉末
       2.細菌培養(yǎng)（陰性）
       3.真菌培養(yǎng)（陰性）

產(chǎn)品規(guī)格

產(chǎn)品優(yōu)勢：

       該款培養(yǎng)基是一種化學成分明確、無人和動物血清的培養(yǎng)基，屬于animal component free級別。使用該培養(yǎng)基無需任何腫瘤細胞系作為滋養(yǎng)層，即可滿足臍帶血、外周血、骨髓來源NK細胞的擴增，培養(yǎng)2周NK細胞擴增1000倍以上，從而為NK細胞免疫治療臨床應用提供了安全性和有效性保障。

應用舉例

       外周血來源單個核細胞

圖1 培養(yǎng)中的NK細胞之培養(yǎng)48小時細胞狀態(tài)(標示：Bar:100 μm)

       將外周血單個核細胞，按照說明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)48小時，可見多個由十數(shù)個細胞組成的簇（cluster），尤其是在培養(yǎng)瓶邊緣處多見。

       依據(jù)我們的經(jīng)驗，在培養(yǎng)早期，這種貼壁的簇主要由NK細胞組成。如果在培養(yǎng)早期出現(xiàn)較多懸浮的簇或集落（colony），提示T淋巴細胞擴增顯著，可能影響最終收獲時NK細胞的比例。

圖2 培養(yǎng)中的NK細胞之培養(yǎng)7天細胞狀態(tài)(Bar:100μm)。

      將外周血單個核細胞，按照說明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)一周時，貼壁的簇或集落逐漸脫壁，懸浮于培養(yǎng)液中。

      根據(jù)我們的經(jīng)驗，如果10×10視野中，較大集落超過3個，或培養(yǎng)基變黃，提示應該補液。

圖3 NK細胞之培養(yǎng)7天流式檢測結果

       收獲人外周血單個核細胞，按照試劑盒提供的方法培養(yǎng)一周后，收集細胞進行抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE標記，F(xiàn)ACSCalibur收集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowjo軟件分析?？梢娭饕獮槿杭毎?，分別是NK細胞(CD3^-/CD56⁺)、T淋巴細胞(CD3⁺/CD56^-)和多種細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK，CD3⁺/CD56⁺)。

       將外周血單個核細胞，按照說明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)7天時，多數(shù)情況下，NK細胞(CD3^-/CD56⁺)比例在30-70%之間。但是，在某些情況下(如腫瘤病人外周血NK培養(yǎng))，培養(yǎng)一周時以CD3⁺/CD56⁺細胞為主，比例可在40%左右。隨著培養(yǎng)時間的延長，CD3和CD56雙陽性比例下降，CD3^-/CD56⁺細胞比例逐漸上升。

圖4 NK細胞之培養(yǎng)14天流式檢測結果

       將外周血單個核細胞，按照說明書的方法，在Clin-SFM?-NK體系中培養(yǎng)14天時，收集細胞進行流式細胞學分析?？梢娂毎后w中以NK細胞(CD3^-/CD56⁺)為主。

       在多數(shù)情況下，NK細胞(CD3^-/CD56⁺)比例在80%以上，最高可達97%。然而，少數(shù)情況下(如腫瘤病人外周血NK細胞培養(yǎng))，CD56陽性細胞比例雖可達到80%以上，但多數(shù)細胞同時表達CD3和CD56(如下圖所示)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因未明，也值得進一步探討。

圖5 外周血培養(yǎng)2周時流式細胞學分析結果

       抽取某一肝癌患者(男，61歲)外周血，進行單個核細胞分離，按照試劑盒操作說明進行培養(yǎng)2周，F(xiàn)CM分析發(fā)現(xiàn)，細胞群體中以多種細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK，CD3⁺/CD56⁺)為主。

產(chǎn)品概述

       本產(chǎn)品是一種化學成分明確、無人和動物血清、無任何動物成分的培養(yǎng)基，適用于人外周血、臍帶血、骨髓等來源NK細胞的培養(yǎng)擴增。產(chǎn)品中所有蛋白質成分均為重組技術獲得，包括重組人白蛋白、重組人轉鐵蛋白等多種成分。產(chǎn)品不含任何抗生素。

       激活劑是為特異性活化NK細胞而設計。激活劑中含有特殊的活性物質，鱟試劑法測定熱源兩者均為陽性（≥0.5U/ml，鱟試劑法）。然而，在培養(yǎng)過程中，該成分不會存在于細胞終產(chǎn)品中，因此，細胞產(chǎn)品熱源測定應為陰性。   

       使用該套裝，培養(yǎng)起始細胞可以為外周血、胎盤/臍帶血或骨髓單個核細胞。一般而言，使用該套裝培養(yǎng)14天，細胞總數(shù)擴增100倍以上，CD56⁺細胞比例超過80%，最高可達到97%。

       激活劑4°C儲存，有效期6個月。NK細胞篩選擴增培養(yǎng)基均4°C儲存，有效期12個月。

       所有成分均應避光保存，不宜劇烈震蕩，以免大分子物質因變性而失活。

技術指標

      （一） 激活劑

       1. 淺白色，半透明

       2. 細菌培養(yǎng)（陰性）

       3. 真菌培養(yǎng)（陰性）

      （二） NK優(yōu)勢擴增培養(yǎng)基

       1. 淺紅色，透明，pH7.1-7.4

       2. 細菌培養(yǎng)（陰性）

       3. 真菌培養(yǎng)（陰性）

       4. 熱源（鱟試劑法）≤0.25U/ml

       5. NK92細胞生長：良好

產(chǎn)品規(guī)格

操作方法

       本操作方法以采集30-50 ml外周血為例，介紹NK細胞誘導擴增培養(yǎng)的具體方法。請仔細閱讀操作手冊，尤其注意每個提醒事項。

1. 培養(yǎng)瓶鋪板

      （1） 建議使用適于貼壁細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶，如由Corning公司生產(chǎn)、底面積為75cm²或175cm²的培養(yǎng)瓶。

      （2） 將激活劑（1 ml）置于37°C復溫10 min，輕輕混勻。

      （3） 培養(yǎng)瓶（175 cm²,Corning）加入激活劑2.0 ml，生理鹽水8ml，混勻?；蛘?，按照下表提供的參數(shù)，使用其它培養(yǎng)瓶鋪板。應提前至少24h鋪板，也可將鋪好的培養(yǎng)瓶置于4°C，可儲存2周。

      （4） 可參考以下表格，包被其它型號的培養(yǎng)瓶。

2. 單個核細胞分離、血漿采集及處理

       1) 開啟水浴箱，調整溫度至56 °C，以備滅活補體用。

       2) 常規(guī)無菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。

       3) 分離單個核細胞前，將已經(jīng)預鋪板的培養(yǎng)瓶放置37°C。

       4) 常規(guī)Ficoll-Hypaque密度梯度離心。建議關閉離心機剎車（brake off）。

       5) 吸取上層稀釋的血漿，56 °C，30 min滅活補體，之后立即置于-20°C靜置2 min，離心（3000 g,15-30 min）以去除血小板。

       6) 收取單個核細胞層，生理鹽水充分混勻。離心洗滌。

       7) 生理鹽水懸浮細胞沉淀，再次離心洗滌。

       8) 使用NK細胞擴增培養(yǎng)基懸浮細胞。計細胞數(shù)。

3. 細胞培養(yǎng)

      1) 取出已經(jīng)預鋪板且置于37°C孵育的培養(yǎng)瓶，吸凈稀釋的激活劑。沿培養(yǎng)瓶側壁加入少量生理鹽水，輕輕洗滌瓶底。吸除。

      2) 根據(jù)細胞計數(shù)結果，將細胞終濃度調整為3×10⁶/ml。單個核細胞懸液中加入IL-2，IL-15和自體血漿，自體血漿終濃度為10%，IL-2和IL-15終濃度分別為1000U/ml及50ng/ml。

細胞濃度以及接種培養(yǎng)瓶的表面積，是決定最終培養(yǎng)NK細胞比例的兩個關鍵因素。我們推薦細胞密度在3×10⁶/ml左右，同時，根據(jù)接種細胞體積選擇適宜底面積的培養(yǎng)瓶。下表可作為參考。

      3) 將細胞懸液加入已經(jīng)預鋪板的培養(yǎng)瓶中，37°C，5% CO2和100%濕度下培養(yǎng)。次日，觀察是否有污染現(xiàn)象；如無，繼續(xù)培養(yǎng)96小時。

      4) 96小時后補充新鮮培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基含IL-2（2000 U/ml）、IL-15（100 ng/ml）和自體血漿2.5-5%。一般情況下，補充液體量為原體積的一倍。

      5) 繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液變黃后，補充新鮮培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基含血漿5%，IL-2（1000 U/ml）和IL-15（50 ng/ml）。補液量一般為補液前原體積的1倍。細胞應在預鋪板的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至少一周。

      6) 當原瓶培養(yǎng)基變黃、總體積接近或達到培養(yǎng)瓶最大體積時，添加等量含血漿5%，IL-2（1000 U/ml）和IL-15（50 ng/ml）的培養(yǎng)基，并分瓶培養(yǎng)。

NK細胞集落常貼壁，可以通過以下方法使貼壁集落懸?。海?）輕輕拍打培養(yǎng)瓶側壁，使貼壁的集落懸?。唬?）或通過吸管吹打，使貼壁的集落懸浮；（3）如仍有較多集落貼壁，則將細胞懸液轉移至新的培養(yǎng)瓶后，加入需要補充的冷新鮮培養(yǎng)基，置于超凈臺中5min，之后輕輕拍打培養(yǎng)瓶側壁，則大部分集落可脫落，與其它細胞混合后培養(yǎng)。

      7) 按照50-100 ml/瓶（225 cm²），將細胞擴增轉移至新培養(yǎng)瓶，原瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)?；蛘撸瑢⑺屑毎麘乙褐苯愚D培養(yǎng)袋培養(yǎng)。

      8) 每天觀察培養(yǎng)基顏色、細胞集落大小及細胞密度，及時補充含血漿、IL-2和IL-15的新鮮培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基總量為原來體積（等量補液）。每次補液前，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側壁，使貼壁的集落懸浮。一般而言，每天或每2天需要補充新鮮培養(yǎng)基。

      9) 培養(yǎng)12-15天，細胞數(shù)達到目的用量后，可進行質量檢驗，之后收獲細胞。

4. 細胞收獲

      1) 將細胞轉移至500 ml離心管，計細胞數(shù)及細胞活力。

      2) 離心收獲細胞，速度為500 g，時間為15 min。

      3) 將細胞轉移至250 ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌，500 g，15 min。

      4) 將細胞轉移至50 ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌，500 g，10 min。

      5) 用含1%注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細胞。

      6) 使用孔徑為70 μm的細胞篩（cell strainer）過濾細胞。

      7) 留小樣備質檢。

      8）將細胞轉移至輸液袋中。靜置于室溫。

5. 注意事項

     （1）預鋪板時間要長，至少過夜，或鋪板后密閉培養(yǎng)瓶瓶口，4 °C最長可儲存2周。

     （2）初始接種體積不易過大，最大量為30 ml/225 cm²培養(yǎng)瓶，20 ml/175 cm²培養(yǎng)瓶，10 ml/75 cm²培養(yǎng)瓶，5 ml/25 cm²培養(yǎng)瓶。將單個核細胞在原培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)超過1周，?？蛇_到較好的效果。

     （3）自體血漿制備過程中去除血小板要徹底，過多的血小板會影響NK細胞活化。自體血漿不夠或不適宜培養(yǎng)時，可用人AB混合血漿。將多份（建議5份以上）人AB血漿凍融后混合，離心（3000g，至少15 min）去除血小板，并添加注射用肝素鈉10 U/ml，以防形成凝膠。

質量檢驗報告書

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